Uهنگامی که دانشمندان برای اولین بار استفاده از CRISPR را برای ویرایش ژنوم در سلول های انسانی آغاز کردند، دری را برای مطالعه ژنتیک بیماری ها باز کرد. در همان روزهای اولیه ویرایش CRISPR-Cas9، یک محقق انکولوژی دقیق فرانسیسکو سانچز-ریورا یک دانشجوی کارشناسی ارشد بود که در مورد ژنتیک سرطان تحقیق می کرد تایلر جکسآزمایشگاه در موسسه فناوری ماساچوست (MIT). در پایان نامه خود، او یکی از اولین کسانی بود که ژنوم موش را با CRISPR-Cas9 در حالی که از عوامل ژنتیکی سرطان ریه بازجویی می کرد، ویرایش کرد. این مطالعات باعث علاقه سانچز-ریورا به ویرایش ژنوم با سرعت بالا شد که به تحقیقات مداوم او در MIT دامن زد.

در اخیر بیوتکنولوژی های طبیعی مطالعه، سانچز-ریورا با یک بیوشیمیست همکاری کرد دیوید لیو در دانشگاه هاروارد برای مطالعه رایج ترین ژن سرطانی جهش یافته: TP53که نگهبان ژنوم را رمزگذاری می کند، پروتئین p53 سرکوبگر تومور. آنها هزاران نوع p53 را با یک کتابخانه جدید حسگر ویرایش هسته با کارایی بالا غربالگری کردند که چگونگی تأثیر جهش های مختلف بر عملکرد پروتئین درون زا را تعیین می کند.

سانچز-ریورا و تیمش دریافتند که جهش‌های خاصی باعث ایجاد فنوتیپ‌هایی می‌شوند که با آنهایی که قبلاً در مدل‌های بیان بیش از حد مشاهده شده بود، متفاوت هستند، به ویژه آنهایی که بر دامنه الیگومریزاسیون تأثیر می‌گذارند که به پروتئین‌های p53 اجازه می‌دهد تترامرهای عملکردی را در سلول‌ها تشکیل دهند. کار سانچز-ریورا اهمیت دوز ژن درون زا را در مطالعه ژنتیک تومور برجسته می کند و چارچوبی را برای تحقیقات انواع ژنتیکی در مقیاس بزرگ برای اکتشافات پزشکی دقیق آینده ایجاد می کند.

چه چیزی شما را به تحقیق درباره ژنتیک سرطان با ویرایش عمده ترغیب کرد؟

سیستم CRISPR-Cas9 برای مهندسی جهش‌های خاص مرتبط با سرطان، مانند انواع تک نوکلئوتیدی، پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی، درج‌ها و حذف‌ها و انواع مختلف بازآرایی‌های کروموزومی مناسب نیست. در طول دوره پسا دکتری من با یک زیست شناس سرطان اسکات لو در مرکز سرطان مموریال اسلون کترینگ، تلاش‌هایم را به سمت فناوری‌های ویرایش دقیق ژنوم، مانند ویرایش مبتنی بر سیتوزین و ویرایش مبتنی بر آدنین، که ابتدا در آزمایشگاه دیوید لیو توسعه داده شد، معطوف کردم. الکسیس کومور (اکنون یک بیوشیمیست در دانشگاه کالیفرنیا، سن دیگو) و نیکول گاودلی (در حال حاضر به ترتیب یک کارآفرین در Google Ventures) است. این فناوری‌ها به ما این امکان را می‌دهند که تغییرات تک نوکلئوتیدی خاص را در ژنوم‌های سلولی مهندسی کنیم و ویرایش ژنوم سوماتیکی را در موش‌ها انجام دهیم. این منجر به استفاده مجدد از ویرایش هسته CRISPR برای ژنومیک عملکردی بالا شد که کار ویرایش اصلی ما را آغاز کرد. ویرایش اولیه توسط دیوید لیو و اندرو آنزالونه (در حال حاضر مدیر Prime Medicine)، و این واقعاً همان چیزی است که من آن را جام مقدس ویرایش دقیق ژنوم می دانم، زیرا به ما امکان می دهد تقریباً هر نوع جهش را مهندسی کنیم.

چگونه ویرایش ژنوم را در طول صفحه نمایش های CRISPR با کارایی بالا اندازه گیری می کنید؟

RNA راهنمای نوکلئاز Cas9 اصلی (gRNA) DNA را مختل می کند و معمولاً باعث از دست دادن عملکرد یا جهش غیرفعال می شود. در این زمینه، تعداد gRNA های جمع آوری شده توسط توالی یابی نسل بعدی، اندازه گیری غیرمستقیم ویژگی های ارتقا دهنده تناسب راهنما را ارائه می دهد. برای ویرایش هسته و ویرایش هسته، خواندن تعداد gRNA ها در یک سلول به اندازه دقیق یا کمی نیست. ما کتابخانه های حسگر را برای کاهش این چالش ها توسعه داده ایم.

کتابخانه های حسگر چیست و چگونه کار می کنند؟

این به ما این امکان را می دهد که همزمان بازده ویرایش و دقت هر pegRNA را در یک کتابخانه همانطور که در سلول ها اتفاق می افتد، کمی کنیم.
-فرانسیسکو سانچز-ریورا، MIT

کتابخانه های حسگر سازه هایی هستند که یک gRNA و یک نسخه مصنوعی از سایت هدف را در همان ساختار رمزگذاری می کنند. اگرچه این یک سایت هدف مصنوعی است که ما آن را طراحی و شبیه سازی می کنیم، در زمینه یک کتابخانه حسگر، این سایت هدف برای تقلید از سایت درون زا تا حد امکان طراحی شده است. ما محل هدف و توالی‌های DNA طرفین را که بر اساس توالی جایگاه درون‌زا هستند، شامل می‌شویم.

قبلاً نشان داده‌ایم که می‌توانیم اندازه‌گیری غیرمستقیم را بدست آوریم پایه را ویرایش کنید رویدادهایی که به صورت درون زا با تعیین توالی این سایت هدف مصنوعی در سازه در طول غربالگری با توان بالا رخ می دهند.² که در این آموزشما یک صفحه از آن کتاب گرفته ایم و یک کتابخانه حسگر اولیه برای ویرایش ایجاد کرده ایم.¹

راهنمای ویرایش اولیه RNA (pegRNA) به طور کلی ساختار پیچیده تری است، اما مفهوم یکسان است. اگر این کتابخانه‌ها را به سلول‌هایی وارد کنیم که ماشین ویرایش هسته را بیان می‌کنند، pegRNA در ساختار، سایت هدف خود را در حسگر ویرایش می‌کند، و اگر کتابخانه‌ها به سلول‌های همان گونه هدف تحویل داده شوند، pegRNA سایت ژنومی درون‌زا را ویرایش می‌کند. . این بسیار قدرتمند است زیرا به ما امکان می دهد همزمان بازده ویرایش و دقت هر pegRNA در یک کتابخانه را همانطور که در سلول ها اتفاق می افتد، کمی کنیم.

چرا هنگام توسعه کتابخانه های ویرایش حسگر اصلی روی p53 تمرکز کردید؟

ما به چند دلیل از p53 به عنوان نمونه اولیه استفاده کردیم. ژنی که کد می کند p53 شایع ترین ژن سرطانی جهش یافته استو هنوز بحث های زیادی در مورد اینکه این جهش ها چه می کنند وجود دارد.³

هر سلول انسانی با دو نسخه از نوع وحشی p53 شروع می شود. به طور معمول، اولین رویدادی که زمانی رخ می‌دهد که یک سلول جهش p53 را به دست می‌آورد، یک جهش نقطه‌ای در یک نسخه است و به دنبال آن از دست دادن رویداد هتروزیگوسیتی است که جهش می‌کند یا دومی را از دست می‌دهد. TP53 کپی ژن تعدادی از مطالعات از روش‌های جهش‌زایی مبتنی بر cDNA اگزوژن یا اسکن جهشی عمیق برای بیان بیش از حد جهش‌های مختلف استفاده کرده‌اند. TP53 ژنرال این مطالعات در سلول‌هایی که نوع وحشی p53 را بیان می‌کنند، مانند سلول‌های آدنوکارسینومای ریه که در مطالعه خود استفاده کردیم، انجام شد.

از نظر ژنتیکی، تنها خاصیتی که می‌توان با این رویکرد اندازه‌گیری کرد، فعالیت منفی غالب است، به این معنی که جهش یافته در زمینه یک تترامر نوع وحشی معرفی می‌شود و فعالیت منفی غالب با این مخزن p53 نوع وحشی تداخل می‌کند. اما جهش یافته های خاصی وجود دارند که می توانند علاوه بر فعالیت منفی غالب، خواص دیگری نیز داشته باشند.

ما می‌خواستیم به نقطه‌ای برسیم که بتوانیم این مدل را به شدت آزمایش کنیم و این کار تازه شروع است. با ویرایش مرتبه اول، ما جهش های درون زا ایجاد کردیم، استوکیومتری، دوز ژن و روش طبیعی ایجاد و پیشرفت این جهش ها را حفظ کردیم. این روش همچنین به ما این امکان را داد که این فناوری را بسیار دقیق ایجاد کنیم، زیرا ما یک انتخاب قوی برای سلول‌هایی با فعالیت p53 مختل اعمال کردیم، بنابراین به سرعت ایده‌ای در مورد پایداری و مقیاس‌پذیر بودن این فناوری پیدا کردیم.

مسیرهای آینده چیست؟

این میدان به سرعت حرکت می کند، اما گاهی اوقات از حرکت آن چنان با سرعت رنج می بریم که فراموش می کنیم مهم ترین آزمایش ها را انجام دهیم. بازجویی مکانیکی از این جهش یافته ها قطعا بخشی از مراحل بعدی ماست. ما به مدل‌های موش بازمی‌گردیم تا انواع مختلف جهش‌ها را در بافت‌های مختلف مهندسی کنیم تا بفهمیم آنها در داخل بدن چه می‌کنند. علاوه بر مدل‌سازی جهش‌های فردی، ما مشتاقانه منتظر انجام ویرایش پایه چندگانه در چارچوب یک آزمایش ژنتیکی با توان بالاتر در مدل‌های موش هستیم، همانطور که در سلول‌ها انجام داده‌ایم.

این مصاحبه برای طولانی بودن و وضوح ویرایش شده است.

منابع

1. گولد SI و همکاران ارزیابی عملکرد بالا انواع ژنتیکی با کتابخانه‌های ویرایش سنسور اصلی. Nat Biotechnol. منتشر شده آنلاین در 12 مارس 2024. doi:10.1038/s41587-024-02172-9
2. سانچز-ریورا FJ و همکاران. کتابخانه‌های حسگر ویرایش اصلی برای مهندسی با توان بالا و تجزیه و تحلیل عملکردی انواع تک نوکلئوتیدی مرتبط با سرطان. Nat Biotechnol. 2022; 40 (6): 862-873.
3. هوانگ جی. پیشرفت های فعلی در هدف قرار دادن مسیر سیگنالینگ p53 برای درمان سرطان. Pharmacol Ther. 2021; 220:107720.