مدارهای مصنوعی کلید چرخاندن ساعت سلولی را آشکار می کنند

ماکثر مردم تعجب می کنند که اگر بتوانند زمان را به عقب برگردانند و در تصمیمات گذشته تجدید نظر کنند، زندگی آنها چگونه تغییر می کند. اگرچه یک شاهکار به ظاهر غیرممکن است، زیست شناسان سلول های بنیادی کازوتوشی تاکاهاشی و شینیا یاماناکا در دانشگاه کیوتو برای اولین بار برگشت ساعت سلولی در سال 2006¹ تاکاهاشی و یاماناکا با بیان بیش از حد چهار فاکتور رونویسی در فیبروبلاست‌های کاملاً تمایز یافته، سلول‌ها را به حالت پرتوان برنامه‌ریزی کردند و آنها را سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (iPSCs) نامیدند.

اگرچه محققان iPSC ها را استخدام کنید در آزمایشگاه و کلینیک، دانشمندان برای تولید موثر مقادیر زیادی iPSC تلاش می کنند.² گفت: “برنامه ریزی مجدد هنوز بسیار ناکارآمد است.” تورستن شلاگر، زیست شناس سلول های بنیادی در بیمارستان کودکان بوستون. “هنوز به طور کامل درک نشده است که چرا 98 یا 99.9 درصد سلول ها دوباره به iPSC ها برنامه ریزی نمی کنند.” پیشرفت علمی در مقاله، Schlaeger و تیمش سیستمی را برای ردیابی سرنوشت سلول ها با پویایی های مختلف بیان فاکتور رونویسی در طول برنامه ریزی مجدد توسعه دادند.³ این یافته ها به محققان در این زمینه اجازه می دهد تا بازده iPSC را بهبود بخشند.

دانشمندان مشکوک بودند که ناهمگونی در نتایج برنامه ریزی مجدد ناشی از تغییرات در سطوح و مدت زمان بیان فاکتورهای رونویسی است. بنابراین، چندین گروه تحقیقاتی تلاش کرده‌اند موفقیت برنامه‌ریزی مجدد را با سطوح فاکتور رونویسی octamer-binding 4 (OCT4)، که یکی از فاکتورهای رونویسی تاکاهاشی و یاماناکا برای فرآیند برنامه‌ریزی مجدد ضروری است، مرتبط کنند. با این حال، این مطالعات از اندازه‌گیری‌های مبتنی بر جمعیت استفاده کردند و سهم OCT4 درون‌زا را در برنامه‌ریزی مجدد در نظر نگرفتند.

همکار شلاگر مجبور به غلبه بر این محدودیت ها شد اقامتگاه دل وکیویک مهندس مکانیک در این رشته در MIT، یک سیستم بیان نوآورانه OCT4 را توسعه داد. دل وکیو به یاد می‌آورد: «این ایده واقعاً تلاش برای استفاده از روش پیچیده‌تری برای بیان بیش از حد فاکتورهای رونویسی برای برنامه‌ریزی مجدد سلول‌های بنیادی بود.

تیم دل وکیو یک مدار ژن مصنوعی را برای بیان بیش از حد نابجا یک نسخه نشاندار شده با فلورسنت از فاکتور رونویسی OCT4 مهندسی کردند و همزمان بیان OCT4 درون زا را از طریق microRNA مسدود کردند. این به محققان اجازه داد تا سطح کل پروتئین OCT4 را در سلول کنترل کنند و با اندازه‌گیری فلورسانس آن را کمی کنند. همچنین، نابجا OCT4 ژن توسط یک پروموتر القایی و پر سر و صدا کنترل می شود، به این معنی که سیستم تنوع در بیان مزدوج OCT4 و طیف وسیعی از مسیرهای ارزیابی ایجاد می کند، مانند سلول هایی که بیان OCT4 را در طول برنامه ریزی مجدد حفظ می کنند یا سلول هایی که بیان آنها در طول زمان کاهش می یابد.

برای تعیین اینکه کدام مسیرهای OCT4 با موفقیت مجدد فیبروبلاست های پوستی انسان را به iPSC ها برنامه ریزی می کنند، دل وکیو، شلاگر و تیم آنها سلول ها را با ناقل های لنتی ویروسی که ژنراتور مسیر OCT4 خود را رمزگذاری می کردند، انتقال دادند و سطوح پروتئین های OCT4 نشاندار شده با فلورسنت را در سلول ها در طول زمان با تصویربرداری ردیابی کردند. سپس محققان کلنی های سلولی به دست آمده را ثابت کردند و آنها را برای دو نشانگر سطحی سلول های بنیادی پرتوان رنگ آمیزی کردند.

آنها مشاهده کردند که کلنی ها به سه دسته تقسیم می شوند: مستعمرات نوع I تنها برای یکی از نشانگرهای سطحی مثبت بودند. مستعمرات نوع II الگوی رنگ آمیزی دقیقا مخالف نوع I را نشان می دهند. و کلنی های نوع III برای هر دو نشانگر مثبت بودند. آنها سلول های مستعمرات نوع III را iPSCs در نظر گرفتند و سلول های مستعمرات نوع I و II را به عنوان ناقص برنامه ریزی مجدد طبقه بندی کردند. علی‌رغم این تفاوت‌ها، سلول‌ها در هر سه نوع کلنی به‌طور پایدار سطوح سوپرافیزیولوژیک OCT4 را در طول برنامه‌ریزی مجدد بیان کردند، که نشان می‌دهد که برنامه‌ریزی مجدد موفق فیبروبلاست‌های پوستی انسان به iPSCها مستلزم سطوح بالای فاکتور رونویسی OCT4 است. اما این پارامتر به تنهایی برای ترویج تولید iPSC ها کافی نیست.

«این مقاله از نظر فنی نوآورانه است. این با کارهای قبلی که نشان می‌داد افزایش سطح OCT4 برای فرآیند برنامه‌ریزی مجدد مهم است، مطابقت دارد دین تانتینیک متخصص ژنتیک در دانشگاه یوتا که در این مطالعه شرکت نداشت.

اگرچه تانتین معتقد است که سیستم دل وکیو روشی هوشمندانه برای بررسی مستقیم سطح کل پروتئین OCT4 در سلول‌های زنده ارائه می‌کند، او پیشنهاد می‌کند که بررسی سطح پروتئین به تنهایی ممکن است کل داستان را بیان نکند. یک سطح پروتئین بر اساس یک نشانگر فلورسنت با فعالیت پروتئین یکسان نیست – توانایی آن برای اتصال به DNA [or] توانایی آن در تنظیم رونویسی پس از اتصال، وی خاطرنشان کرد: “بنابراین، من فکر می‌کنم اکنون جایی که این زمینه باید انجام شود، است. [to find out] چگونه فعالیت OCT4 به طور پویا در طول تنظیم می شود [reprogramming]” او خاطرنشان کرد. با تکیه بر این ایده، تانتین و تیمش اخیرا دریافتند که فعالیت OCT4 در طول برنامه ریزی مجدد و تمایز ردوکس تنظیم شده استو او مشکوک است که تنظیم سایر اجزای برنامه ریزی مجدد در سال های آینده مورد توجه قرار گیرد.⁴

دل وکیو امیدوار است که کار او الهام بخش دیگر محققان باشد تا فراتر از روش های استانداردی که برای تشریح مسیرهای مولکولی استفاده می کنند فکر کنند. دل وکیو گفت: «این مطالعه نشان می‌دهد که چگونه می‌توان از ابزارهای پیچیده‌تر مهندسی ژنتیک در زمینه یک فرآیند بیولوژیکی بسیار پیچیده استفاده کرد و به شما کمک کرد اطلاعاتی را به دست آورید که در غیر این صورت به‌دست آوردن آن‌ها دشوار است».

Schlaeger می‌خواهد از دانش به‌دست‌آمده در این مطالعه برای توسعه درمان‌های مبتنی بر iPSC مانند سلول‌های CAR T استفاده کند و معتقد است مهندسی دقیق کلید تحویل ایمن این محصولات به کلینیک خواهد بود. شلاگر می‌گوید: «با سلول‌ها، می‌خواهیم به آن کنترل دقیق برسیم و این تنها با کلیدها و مدارهای ژنتیکی پیچیده قابل انجام است.

منابع

1. تاکاهاشی کی، یاماناکا اس. القای سلول های بنیادی پرتوان از کشت فیبروبلاست جنینی و بالغ موش توسط فاکتورهای تعریف شده. سلول. 2006; 126 (4): 663-676.
2. شی وای و همکاران فناوری سلول های بنیادی پرتوان القایی: یک دهه پیشرفت. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16 (2): 115-130.
3. ایلیا ک و دیگران. مدارهای ژنتیکی مصنوعی برای نشان دادن مسیر OCT4 برنامه ریزی مجدد موفق فیبروبلاست انسانی. Sci Adv. 2023؛ 9 (48): eadg8495.
4. شن زی و همکاران حساسیت ردوکس Oct4 برنامه ریزی مجدد و تمایز را تقویت می کند. پیش چاپ. bioRxiv. 2023:2023.02.21.529404.