یک ابزار CRISPR برای کار با رونوشت انسان

Lمهندسی مبتنی بر CRISPR مانند عملکرد یافتن و جایگزینی یک واژه‌پرداز، به دانشمندان اجازه می‌دهد تا توالی‌های DNA را با دقت جفت پایه به سرعت و کارآمد ویرایش کنند. از او به عنوان دموکراتیزه کننده بزرگ ویرایش ژن استقبال می شود، فناوری های CRISPR مدل‌سازی بیماری‌ها، ژنومیک عملکردی و درمان‌های ژنی پیشرفته دارند.¹ با این حال، چنین ابزارهای ویرایش RNA محدود باقی می مانند.

در نگاه اول، ممکن است ویرایش یک مولکول گذرا مانند RNA زمانی که ابزارهایی برای هدف قرار دادن ریشه مشکل وجود دارد، غیر منطقی به نظر برسد: DNA. با این حال، ویرایش DNA بدون خطر نیست، مانند جهش‌های خارج از هدف، و ماندگاری آن در مواقعی که نیاز به یک اصلاح موقت است، مانند مداخلات رشدی یا درمان کوتاه‌مدت سرطان، محدود می‌شود. گفت: اینجاست که ویرایش RNA واقعاً می تواند بازی را تغییر دهد آنا نمودرایازیست شناس مولکولی در دانشگاه ایالتی مونتانا (MSU).

در مقاله ای که در علوم پایهنمودرایا و همکارانش از a سیستم منحصر به فرد CRISPR برای جدا کردن RNA در سلول های انسانی و شناسایی مکانیسم ترمیم که سلول ها برای جمع آوری مجدد مولکول استفاده می کنند.² این تیم با استفاده از مدل‌های سلولی نشان دادند که فناوری آنها یک جهش ایجاد کننده بیماری را که در بیماران مبتلا به فیبروز کیستیک شایع است، قطع می‌کند. این یافته‌ها پتانسیل درمانی ویرایش RNA قابل برنامه‌ریزی را برجسته می‌کنند، اما همچنین ابزاری را برای مطالعه سؤالات اساسی‌تر در زیست‌شناسی RNA در اختیار محققان قرار می‌دهند – مانند اینکه چگونه و چرا سلول‌های انسانی RNA را ترمیم می‌کنند؟

گفت: «مقاله به طور کلی بسیار خلاقانه است دیوید کاکس، یک متخصص ژنتیک در دانشگاه استنفورد که در این تحقیق شرکت نداشت. “[This technology] به زرادخانه ابزارهای ویرایش RNA موجود، به ویژه برای سلول های پستانداران، اضافه می کند.

“[The research] آنها گفتند که از مشاهداتی که در طول همه‌گیری COVID-19 انجام دادیم الهام گرفته شده است آرتیوم نمودری، یک متخصص ژنتیک در MSU و یکی از نویسندگان مقاله. در سال 2020، نمودری و نمودرایا سیستم‌های CRISPR را مطالعه کردند بلیک ویدنهفتآزمایشگاه، اما آنها برای مطالعه جهش در ویروس SARS-CoV-2 دنده‌ها را تغییر دادند و به یک تلاش جهانی برای درک چگونگی تغییر ژنوم این ویروس RNA در طول زمان پیوستند. در حین بررسی جهش در ORF7a، یک پروتئین کمکی ویروسی که با پاسخ های ضد ویروسی میزبان مخالفت می کند، یک سویه نادر با حذف 115 نوکلئوتید در طول در ژنوم RNA بلند 30000 نوکلئوتیدی ویروس.³

با در دسترس قرار گرفتن درمان‌ها و واکسن‌ها، محققان فرصت پیدا کردند که بدانند چگونه ویروس‌های RNA حذف‌شده‌ها را در ژنوم خود ترمیم می‌کنند و شروع به جستجوی ابزارهایی کردند که به آنها اجازه می‌دهد مستقیماً بریدگی در RNA ویروسی ایجاد کنند. اندونوکلئازهای هدایت شده با CRISPR یک مسیر واضح بودند، اما برای RNA گزینه ها کم و ناقص بودند. Cas13 برای از بین بردن RNA مفید بود اما باعث آسیب جانبی به RNA غیر هدف شد. اگرچه جهش یافته با نوکلئاز غیرفعال شده است dCas13 منجر به برش خارج از هدف نشد، قابلیت های ویرایش آن هنوز محدود است – آنها نمی توانند حذف های قابل برنامه ریزی را در یک مکان خاص در توالی RNA القاء کنند.⁴

نمودری گفت: “انگیزه ما برای این کار این بود که امکانات دیگری را برای ویرایش RNA باز کنیم.” او به دنبال سیستمی بود که بتواند بخش هایی از اسیدهای نوکلئیک را در ژنوم ویروسی جایگزین یا حذف کند. تیم تحقیقاتی بر روی یک مجتمع CRISPR نوع III فرود آمدند که مانند Cas13 RNA را هدف قرار می‌دهد، اما این کار را به روشی عجیب یا بهتر بگوییم عجیب انجام می‌دهد: RNA را در داخل می‌شکافد. شش نوکلئوتید افزایش می یابد.⁵ نمودرایا گفت: «سیستم CRISPR نوع III بسیار پیچیده و منحصر به فرد است.

در مطالعه ای که سال گذشته در پیشرفت علمیمحققان از این ریبونوکلئاز CRISPR برای ایجاد برش هایی با شش نوکلئوتید از یکدیگر استفاده کردند RNA ویروسی برای حذف یا درج برنامه ریزی شده در ژنوم.⁶ پس از این موفقیت ویروسی، محققان به این فکر افتادند که آیا این سیستم CRISPR نوع III می تواند RNA انسان را نیز ویرایش کند. برای آزمایش این، آنها سیستم را به سمت دو رونوشت که در رده سلولی HEK293T بسیار بیان می‌شوند هدف گرفتند و سپس RNA را توالی‌یابی کردند.

نمودری گفت: «هیجان‌انگیزترین لحظه در این مقاله زمانی بود که اولین سکانس را دریافت کردیم. محققان در حال بررسی تراز خواندن توالی بودند که متوجه شکاف هایی شدند که با الگوی برش شش نوکلئوتیدی سازگار بود. «آن نوع شش، 12 یا 18 ضربه [nucleotides]آنها به طور تصادفی رخ نمی دهند – در آن زمان بود که ما می دانستیم وجود دارد [RNA] نمودری گفت که بازسازی ادامه دارد.

هنگامی که کمپلکس های CRISPR نوع III RNA را می شکافند، یک مشخصه از خود باقی می گذارند اثر انگشت شیمیایی در هر یک از دو محل برش.⁷ در سلول های پستانداران، درون زا انتقال پیوند RNA همان علائمی را ایجاد می کند که RNA لیگاز RTCB دوباره به آن می پیوندد.⁸ آزمایش‌های شکست RTCB و بیان بیش از حد به تأیید این موضوع کمک کرد که این آنزیم خیاطی آسیب‌های ناشی از یک عامل برون‌زا، مجموعه CRISPR را نیز ترمیم می‌کند.

“به عنوان کسی که در زمینه مهندسی RNA و RNA کار کرده است، بسیار شگفت انگیز است که این [CRISPR-guided] کاکس گفت: شکستگی های RNA ترمیم می شوند. از آنجایی که RNA یک مولکول گذرا است، اصل این است که سلول رونوشت های آسیب دیده را پاک کرده و نسخه های جدید را سنتز می کند. نمودری گفت: ما به نقش فیزیولوژیکی این فرآیند علاقه مندیم. “آیا سلول ها RNA را ترمیم می کنند و چرا؟”

محققان برای بررسی کاربرد بالینی فناوری خود، آن را در مدل سلولی فیبروز کیستیک آزمایش کردند که بیانگر جهش در تنظیم کننده هدایت غشایی گذرنده فیبروز کیستیک است.CFTR) رونوشت. این جهش، یک کدون توقف زودرس، پس از ورود رونوشت به سیتوپلاسم، زنگ هشدار سلول را به صدا در می آورد و قبل از اینکه تبدیل به یک پروتئین کاربردی شود، باعث تخریب آن می شود. سطوح ناکافی CFTR بر انتقال یون در ریه ها تأثیر می گذارد و به ایجاد فیبروز کیستیک کمک می کند. محققان CRISPR نوع III را برای هدف قرار دادن جهش یافته برنامه ریزی کردند CFTR متن. کمپلکس CRISPR که حاوی یک نشانگر ویژه است که بیان آن را در هسته سلول محلی می کند، mRNA معیوب را قبل از فرار به داخل سیتوپلاسم شکار و ویرایش می کند.

اگرچه محققان نشان دادند که ابزار ویرایش RNA آنها برای شکستن و ترمیم برش است CFTR جهش، راندمان پایین است، چیزی که محققان به آن اشاره می کنند یک مشکل رایج است که همه ویراستاران CRISPR در اوایل توسعه خود با آن مواجه می شوند. آنها همچنین خاطرنشان کردند که نسخه فعلی CRISPR نوع III ذهن خود را دارد و الگوی برش خود را از هدف به هدف تغییر می دهد. به عنوان مثال، یک مجتمع می تواند سه برش ایجاد کند و 12 نوکلئوتید را در یک هدف برش دهد، اما چهار برش برای حذف 18 نوکلئوتید در هدف دیگر ایجاد کند. با تغییرات بیشتر در سیستم، آنها امیدوارند که برای دستیابی به ویرایش دقیق تر و کارآمدتر RNA، از ریبونوکلئاز پیشی بگیرند.

نمودری و نمودرایا که در شش سال گذشته در کنار یکدیگر روی نیمکت کار کرده‌اند، گروه تحقیقاتی خود را در دانشگاه فلوریدا در پاییز امسال تأسیس خواهند کرد و در آنجا به این تلاش‌ها ادامه خواهند داد.

Nemudraya که امیدوار است از سیستم برش و تعمیر هدایت شده توسط CRISPR برای بررسی بیشتر مکانیسم‌های تعمیر RNA استفاده کند، گفت: «زیبایی این کار این است که فقط یک فناوری نیست، بلکه ما یک ابزار ایجاد کرده‌ایم.»